L’action, qui s’appuie sur des faits historiques, se déroule en 1536 au château de Windsor, puis à la tour de Londres. Lassé de sa deuxième épouse Anne Boleyn (Anna Bolena), le roi d’Angleterre Henri VIII a jeté son dévolu sur une demoiselle de compagnie de la reine, Jane Seymour. Le roi rappelle d’exil Henry Percy, ancien fiancé de la reine, pour inventer une accusation d’adultère. La reine et Percy sont arrêtés, emprisonnés, jugés et condamnés à mort.
L’opéra se concentre sur les derniers instants cruciaux de la vie d’Anna Bolena : sa lutte pour rester au pouvoir, le piège qu’Henry lui tend pour l’en évincer, la confrontation avec son premier amour, et avant tout le rapport avec sa concurrente et amie, ainsi que sa mort.